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 ● Phosphoprotéomique et analyse de phosphopeptides



L’analyse du phosphoprotéome est délicate et présente plusieurs difficultés :

L’analyse quantitative relative permettant de comparer le phosphoprotéome de plusieurs échantillons requiert un marquage isotopique des peptides. Ce marquage peut être réalisé de façon métabolique par l’incubation de cellules en culture avec des acides aminés marqués isotopiquement (méthode « SILAC ») ou de façon chimique après digestion des protéines lorsque le matériel biologique ne peut pas être marqué métaboliquement. Chaque fois que le marquage métabolique est possible, il devra être préféré au marquage chimique puisqu’il permet de mélanger très rapidement les échantillons à analyser ce qui limite les variations expérimentales. Dans les deux cas, il convient de considérer que l’analyse nécessite une quantité importante de matériel de départ pour réaliser une étude permettant d’identifier des phosphopeptides relativement minoritaires : plusieurs milligrammes de protéines de chaque échantillon (idéalement 10 mg par échantillon) sont en effet nécessaires pour espérer identifier plusieurs milliers de peptides phosphorylés dans des cellules eucaryotes. La technique utilisée par la plateforme associe un fractionnement de l’extrait peptidique total par chromatographie d’échanges d’ions et des séparations des phophopeptides par affinité pour différents oxydes métalliques.

Les phosphorylations sur les résidus tyrosine sont beaucoup moins fréquentes que les phosphorylations sur des résidus sérine ou thréonine (la fréquence moyenne chez les mammifères est S : 80%, T : 19%, Y : 1%). Les phosphorylations sur tyrosine sont généralement des événements précoces lors de l’activation de certains types de récepteurs ; récepteurs à activité tyrosine kinase (RTK) et récepteurs de cytokines en particulier. Ces phosphorylations sur tyrosine sont ensuite relayées par des phosphorylations sur des résidus S ou T. Une analyse globale du phosphoprotéome ne permet généralement d’identifier qu’une proportion très faible des peptides phosphorylés sur Y. Si l’activation de tyrosine kinase(s) est supposée, il est fortement souhaitable de compléter une analyse globale du phosphoprotéome par une analyse spécifique des peptides phosphorylés sur résidus tyrosine.

La plateforme a mis en place des méthodes pour répondre à l’ensemble de ces problèmes : méthodes de marquage métaboliques ou chimiques, d’enrichissement en phosphopeptides globaux ou spécifiquement phosphorylés sur tyrosine, analyse par spectrométrie de masse.

Des anticorps susceptibles d’immunoprécipiter des peptides phosphorylés sur des sites typiques de certaines kinases sont disponibles commercialement. Il existe par exemples des anticorps reconnaissant la séquence R/KXXR/KpS/pT qui est fréquemment phosphorylée par différentes kinases dont Akt. Ces anticorps peuvent être utilisés pour identifier les substrats de certaines kinases (voir Moritz et al., 2010 : Akt-RSK-S6 kinase signaling networks activated by oncogenic receptor tyrosine kinases. Sci Signal 3, ra64.). N’hésitez pas à nous contacter pour ces analyses.

Les méthodes décrites ci-dessus sont destinées à identifier un nombre maximum de peptides phosphorylés dans des mélanges complexes, typiquement des lysats cellulaires ou tissulaires totaux. Une autre question fréquemment posée est la recherche de résidus phosphorylés sur une protéine particulière. Contrairement à ce que pourrait laisser supposer la simplicité apparente de la question posée, sa résolution est souvent beaucoup plus difficile que l’identification globale (qui n’est jamais exhaustive) d’un phosphoprotéome. La plateforme réalise ce type d’analyse mais il faut savoir :


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