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 ● Analyse MS simple de molécule purifiée



Une vérification par MS simple sur un mélange non complexe (petite molécule purifiée) permet d’obtenir rapidement les renseignements suivants :

  • la pureté d’un peptide ou d’une petite protéine
  • la masse d’un peptide ou d’une petite protéine et par conséquent :
    • le nombre de pont disulfure contenu dans un peptide (leur localisation nécessite une analyse un peu plus approfondie)
    • une éventuelle modification portée par le peptide ou la petite protéine

Le choix du spectromètre de masse utilisé dépend notamment de la masse de la molécule purifiée à analysée. Pour une masse inférieure à 10kDa la molécule sera analysée par dépôt simple sur cible MALDI puis par MALDI-TOF. Pour une masse supérieur à 10kDa la molécule sera analysée par infusion directe en ESI-OrbiTrap.

Recommendation de préparation d’échantillon pour une analyse Orbitrap en infusion directe :

Le but d’une analyse de protéines purifiées est de déterminer sa masse exacte.

L’infusion d’une solution de l’ordre de 1µM de protéines dans un volume de 100µl minimum (1-2% acide formique, 50%Méthanol). Attention : la concentration en protéine d’intérêt de l’échantillon initiale doit laisser une marge de dilution suffisante pour atteindre une concentration en contaminant (sel détergeant et autre) compatible avec la MS. Autrement dit, plus la concentration initiale en contaminant est élevé plus la concentration initiale en protéine doit l’être aussi (concentration initiale à 10µM si l’échantillon contient de nombreux contaminants concentrés, 0.1µM si la protéine est pure).

Cas test sur un échantillon « sale » : analyse d’hémoglobine à partir d’1µl de sang

Hémoglobine : 17kDa, 170g/l de globules rouges soit 85g/l de sang. Une dilution au 1/1000 de l’échantillon (1µl de sang dans 1ml du solvant ci-dessus) permet de mesurer une belle distribution des états de charges (avec en final 85ng/µl soit 5µM d’hémoglobine).

Le même spectre déconvolué avec le logiciel ThermoXcalibur QualBrowser (Xtract)

Dessalage :

Diluer fortement (100 à 10 000 fois) une solution concentrée reste la meilleure et la plus rapide des approches pour être compatible avec la MS (réduction des concentrations en sels, détergents et tampons). Si les concentrations en protéines sont dès le départ trop faible et ne permettent pas de diluer autant, il faudra passer par un dessalage et éventuellement une concentration via microcon ou par Zip-tip C4 (>50 kDa) ou C18 (<50 kDa).

Avant dessalage

Après dessalage

Gamme de dilution :

Dans le cas d’une dilution sériée (100 à 10 000 fois), l’analyse se fait en partant du plus dilué vers le plus concentré ce qui évite de rincer la seringue entre les essais sur le même composé.

Détermination de la masse de la proteines purifiés

Les états de charge doivent être visibles. Si la masse n’est pas trop élevée, l’écart de la distribution isotopique permet de déterminer l’état de charge :

z = 1/écart entre deux isotopes

Spectre bien résolu

Spectre mal résolu

Si les massifs isotopiques ne sont pas assez résolus, il faut relever les masses moyennes de 2 massifs d’états de charge sucessifs et ainsi :

z= (m/z+1+1,008)/ (m/z-m/z+1)

Une fois z déterminé, on obtient la masse moyenne de la proteine en effectuant le calcul suivant :

Massemoyenne = ((m/z)*z)-z

Voir aussi : http://www.ionsource.com/tutorial/spectut/spec5.htm




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Date de modification : 2012-02-21 19:21:22





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